质粒转化、细胞转染步骤

质粒转化、细胞转染步骤

转化:将质粒DNA或以其为载体构建的重组DNA导入细菌体内使之获得新的遗传特性。

转染(transfection):将含有目的gene的载体转到真核cell内

转导:指以噬菌体为载体,在细菌之间转移DNA的过程。有时也指在真核cell之间通过逆转录病毒转移和获得cellDNA的过程。

1.质粒转染(transfection)

6-well-plate每well 60-70%时transfection

接种时2.5×105个/ml/well

质粒DNA转染液优化培养基opti-MEM

步骤:2.5ug质粒DNA + 200ul opti-MEM + 6ul转染液混匀室温静置15min

待转染cell换优化培养基opti-MEM 1.3ml,切记要轻轻加培养基,勿冲起cell

把transfection complex(200ul)轻轻均匀滴入cell培养基中,十字形摇晃plate,混匀

37℃,CO2培养箱培养

2.

转化:外源DNA(质粒作为载体)导入受体细胞(大肠杆菌感受态cell)步骤:

50ul感受态cell(一管)加入12ul质粒DNA→轻柔混合

冰浴30min

42℃热激90s

迅速冰浴2min

向管中加入培养基,混匀后37℃震荡培养(﹤225rpm)1h,使细菌恢复正常生长状态

涂板正培1h后,倒培过夜